Inter-Organelle NAD Metabolism Underpinning Light Responsive NADP Dynamics in Plants.

Upon illumination, photosystem I in chloroplasts catalyzes light-driven electron transport from plastocyanin to ferredoxin, followed by the reduction of NADP+ to NADPH by ferredoxin:NADP+ reductase for CO2 fixation. At the beginning of photosynthesis, NADP+ supply control is dominated by de novo NADP+ synthesis rather than being recycled from the Calvin cycle. Importantly, ferredoxin distributes electrons to NADP+ as well as to thioredoxins for light-dependent regulatory mechanisms, to cyclic electron flow for more adenosine triphosphate (ATP) production, and to several metabolites for reductive reactions. We previously demonstrated that the NADP+ synthesis activity and the amount of the NADP pool size, namely the sum of NADP+ and NADPH, varies depending on the light conditions and the ferredoxin-thioredoxin system. In addition, the regulatory mechanism of cytoplasmic NAD+ supply is also involved in the chloroplastic NADP+ supply control because NAD+ is an essential precursor for NADP+ synthesis. In this mini-review, we summarize the most recent advances on our understanding of the regulatory mechanisms of NADP+ production, focusing on the interactions, crosstalk, and co-regulation between chloroplasts and the cytoplasm at the level of NAD+ metabolism and molecular transport.

Functional identification and subcellular localization of NAD kinase in the protozoan parasite Giardia intestinalis / Identificación funcional y localización subcelular de la NAD quinasa en el parásito protozoario Giardia intestinalis / Identificação funcional e localização subcelular da NAD quinase no parasita protozoário Giardia intestinalis

Abstract Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADP) is an essential biomolecule that participates in the redox homeostasis and synthesis of signaling compounds. NAD kinase (NADK) (EC 2.7.1.23 / 2.7.1.86) is the only enzyme capable of synthesizing NADP. This study offers an approach to the NADP metabolism in the parasite Giardia intestinalis, the etiological agent of giardiasis, a disease of high prevalence in America, Asia and Africa. Through bioinformatics tools a NADK enzyme candidate was identified, whose tertiary structure modeling demonstrated distinctive and universal motifs of characterized NADKs. The corresponding recombinant protein (His-GINADK) was expressed in Escherichia coli BL21 (DE3) and its partial purification was achieved by nickel affinity chromatography. Functional identification, which showed NADP synthesis, was completed through enzymatic assays evaluated by RP-HPLC. A cytosolic localization of the endogenous GINADK enzyme was observed in trophozoites throughout indirect immunofluorescence analysis, using polyclonal antibodies produced in mice by its immunization with the His-GINADK protein, purified from inclusion bodies. Taken together, our results contribute to the understanding of the NADP metabolism and the physiological role of NADK in the Giardia model.

Resumen El dinucleótido de adenina y nicotinamida fosfato (NADP) es una biomolécula esencial que participa en la homeostasis redox y en la síntesis de compuestos de señalización. La única enzima capaz de sintetizar NADP es la NAD Quinasa (NADK, EC 2.7.1.23 / 2.7.1.86). En este estudio se presenta un acercamiento al metabolismo del NADP en el parásito Giardia intestinalis, agente etiológico de la giardiasis, una enfermedad de alta prevalencia en América, África y Asia. Mediante herramientas bioinformáticas se identificó un candidato a NADK, cuya predicción a nivel de estructura terciaria mostró motivos característicos y universales de NADKs previamente caracterizadas. La proteína recombinante correspondiente (His-GINADK) se expresó en Escherichia coli BL21 (DE3) y se purificó parcialmente mediante cromatografía de afinidad a níquel. La síntesis de NADP por parte de la proteína His-GINADK se comprobó mediante ensayos enzimáticos evaluados por RP-HPLC. Adicionalmente, se determinó una localización subcelular citosólica en trofozoítos del parásito, empleando inmunofluorescencia indirecta y anticuerpos policlonales producidos en modelos murinos inmunizados con la proteína His-GINADK purificada a partir de cuerpos de inclusión. Los resultados obtenidos representan un avance en el entendimiento del metabolismo del NADP y de la importancia fisiológica de la NADK en el modelo de Giardia.

Resumo A nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADP) é uma biomolécula essencial que participa na homeostase redox e na síntese de importantes compostos de sinalização. A NAD quinase (NADK) (EC 2.7.1.23 / 2.7.1.86) é a única enzima capaz de sintetizar o NADP. Este estudo apresenta uma abordagem do metabolismo do NADP no parasita Giardia intestinalis que causa giardíase, uma doença de alta prevalência na América, Ásia e África. Através de ferramentas de bioinformática, um candidato a enzima NADK foi identificado no parasita, cuja modelagem de estrutura terciária, demonstra motivos distintos e universais de NADKs caracterizadas. A correspondente proteína recombinante (His-GINADK) foi expressa em Escherichia coli BL21 (DE3) e a sua purificação parcial foi conseguida por cromatografia de afinidade com níquel. A identificação funcional, que mostrou a síntese de NADP, foi completada através de ensaios enzimáticos avaliados por RP-HPLC. Uma localização citosólica da enzima GINADK endógena foi observada em trofozoítos ao longo da análise de imunofluorescência indireta, utilizando anticorpos policlonais produzidos em camundongos, imunizados com a proteína His-GINADK purificada de corpos de inclusão. Em conjunto, nossos resultados contribuem para a compreensão do metabolismo do NADP e da importância fisiológica do NADK no modelo de Giardia.